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En busca del amor verdadero, Kanako Miyamae se traslada a la escuela católica Ame no Kisaki, inspirada por cómo sus padres se enamoraron allí. Sin embargo, solo hay una diferencia: debido a que los hombres hacen que a Kanako le dé urticaria, en realidad ella ha venido a la escuela para niñas en busca de una pareja del mismo sexo. Cuando conoce a la bella Mariya Shidou, Kanako cree que ha encontrado a esa persona especial; sin embargo, hay más en Mariya de lo que parece: resulta que el primer amor de Kanako es en realidad un chico travestido. Mariya amenaza con exponer las intenciones impuras de Kanako a menos que mantenga en secreto su verdadero género y, para empeorar las cosas, él también reemplaza a su compañera de cuarto original para poder vigilarla de cerca. Maria+Holic sigue a Kanako mientras busca el amor en los lugares equivocados y busca a la chica de sus sueños, es decir, si puede sobrevivir siendo la compañera de cuarto de Mariya.